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    上海研域生物原代細胞凍存和復(fù)蘇?檢測方法包括以下步驟

    發(fā)布時間: 2024-05-28  點擊次數(shù): 756次

    我們知道,在原代細胞培養(yǎng)檢測實驗在實驗儀器等工作上都要耗費不少的人力和體力。好在很久以前就有高人發(fā)明了原代細胞保存這個實驗步驟,將暫時多出來的原代細胞冰凍保存,保存細胞活力。


    原代細胞復(fù)蘇是一個簡單的試驗操作,但操作中也有許多需要注意的事項,在實驗操作中注意細小的問題,才能使復(fù)蘇后的細胞保持良好的狀態(tài),針對原代細胞復(fù)蘇應(yīng)該注意以下幾點:

    1. 可以提前把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里,擰松瓶蓋,放到孵箱里30分鐘--1個小時; 

    2. 為防止凍存管在升溫時出現(xiàn)爆裂等情況,可以在放入水浴前就把超凈臺里的蓋子擰松一下然后再擰上;

    3. 水浴溫度37℃左右。


    一、慢凍程序

    1.  標(biāo)準(zhǔn)程序:采用細胞凍存器

    當(dāng)溫度在-25 ℃以上時,1~2 ℃/min;

    當(dāng)溫度達-25 ℃以下時,5~10 ℃/min;

    當(dāng)溫度達-100℃時,可迅速放入液氮中。

    2.  簡易程序:將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內(nèi),紗布袋系以線繩,通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口,按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度,在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜,次日早晨投人液氮中。

    3.  傳統(tǒng)程序:冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽長期儲存。


    二、低溫保護劑的應(yīng)用

    在細胞凍存時加入溫保護劑,能大大提高凍存效果。

    常用的低溫保護劑是DMSO,它是一種滲透性保護劑,可迅速透入細胞,提高胞膜對水的通透性,降低冰點,延緩凍結(jié)過程,能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外,在胞外形成冰晶,減少胞內(nèi)冰晶,從而減少冰晶對細胞的損傷。


    三、保存細胞的復(fù)蘇方法

    1.  快速解凍

    凍存細胞從液氮中取出后,立即放入37℃水浴中,輕輕搖動冷凍管,使其在1 分鐘內(nèi)全部融化(不要超過3 分鐘)。

    2.  解凍后的細胞可直接接種到生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng),24小時后再用新鮮培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液,以去除DMSO。

    3.  如果細胞對冷凍保護劑特別敏感

    解凍后的原代細胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑,然后再接種到生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。


    上海研域生物應(yīng)保證清潔,整個操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸,并可以使實驗中用到的“花板"降至限度。從而提高檢測的特異性,并得到更準(zhǔn)確、可靠的實驗結(jié)果。

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